Публикации и СМИ

Популяции Phytophthora infestans на Северном Кавказе

Популяции Phytophthora infestans на Северном Кавказе

Ф. Х. Аматханова¹, Ю. Т. Дьяков¹, Я. В. Петрунина¹, М.А. Побединская¹, С. Н. Еланский ², И. Н. Козловская², Б. Е. Козловский², Е. В. Морозова ², А. Н. Смирнов ³

Phytophthora infestans populations on the Northern Caucasus

1 – Московский Государственный Университет им. М.В. Ломоносова, Биологический ф-т., каф. микологии и альгологии, 119992, Москва, Ленинские горы, д.1, к. 12; 2 – ВНИИ Фитопатологии РАСХН, 143050, Московская обл., п/о Б. Вяземы, e-mail: elansky@yahoo.com; 3 – Московская Сельскохозяйственная академия им. К.А. Тимирязева, 127550, Москва, Лиственничная аллея, 2a, 12.

Введение

Фитофтороз распространен в большинстве картофелеводческих регионов России. Особенно вредоносен при умеренных температурах от 18 до 21^оС и высокой относительной влажности воздуха – 90–100% (Букасов, Камераз, 1972). Степень и периодичность развития фитофтороза и, следовательно, ущерб, причиняемый урожаю, варьируют в зависимости от почвенно-климатических зон, погодных условий вегетационного периода, времени появления первых признаков заболевания, устойчивости сорта, системы защитных мероприятий и других факторов. Наибольший ущерб заболевание причиняет в регионах массового производства картофеля - в северо-западном районе, на Дальнем Востоке, в центральных и северных районах Нечерноземной зоны (Новотельнова, 1974).

На Северном Кавказе в 1990–х и в начале 2000–х годов болезнь развивалась на производственных и селекционных посадках картофеля в горной и равнинной зонах Ингушетии и Северной Осетии и в степной зоне Ставропольского края. Как правило, в этих местах фитофтороз появляется во второй половине июня и в эпифитотийные годы уже в конце июля отмечается почти полная гибель ботвы. В горной зоне, несмотря на более позднее проявление болезни, ее развитие идет интенсивнее, чем в равнинных районах, и гибель ботвы наступает ранее, чем в других зонах (Виноградова, Катаева, 1953; Политыко, 1994).

В течение последних лет на территории Северного Кавказа наблюдалось постепенное исчезновение простых рас и появление комплексных рас в популяции P. infestans. Комплексные расы наблюдали в течение всего вегетационного периода. Они встречались на сортах с некомплиментарными генами устойчивости. В конце 1980-х годов на Северном Кавказе был обнаружен половой процесс. В природных популяциях паразита были обнаружены штаммы с типами спаривания А1, А2 и самофертильные изоляты при преобладании А1 (Политыко, 1994).

Основным источником весеннего возобновления фитофтороза являются перезимовавшие в хранилище пораженные семенные клубни, попавшие в посадочный материал (Дорожкин, Бельская, 1975). Кроме того, весеннее возобновление инфекции может происходить из перезимовавшего в почве или в растительных остаках мицелия или ооспор гриба (Бордукова, 1940; Багирова и др., 1996). Ооспоры P. infestans, полученные на питательных средах, сохраняют в почве в Московской области жизнеспособность и инфекционность на протяжении 3 – 4 лет (Воробьева и др., 1991), а в Краснодарском крае до 5 лет (Бессмельцев, 1991). В условиях Северной Осетии при анализе перезимовавших стеблей и почвы были обнаружены ооспоры; жизнеспособный мицелий гриба был выделен в чистую культуру с естественно зараженных стеблей картофеля, перезимовавших в горной зоне на поверхности почвы, и из их ризосферы (Политыко, 1994).

Цель нашего исследования – изучить популяционную структуру и встречаемость ооспор P. infestans на территории Северного Кавказа и провести сравнительную оценку с популяциями из других регионов РФ.

Материал и методы

Происхождение изолятов. Пораженные фитофторозом образцы листьев картофеля собраны в 2001 и 2002 годах в четырех регионах Северного Кавказа: Северная Осетия (далее РСО)– сорта картофеля Адретта, Горский, Символ (образцы анализировались без учета сорта), Ингушетия (РИ) – сорт Лорх, Кабардино – Балкария (РКБ) – сорт Нарт, Ставропольский край, Кисловодск (СК) – сорт Волжанка. Все образцы проанализированы на наличие ооспор. Образцы собирали с растений (1-2 образца на одно растение), отстоящих друг от друга на расстояние 3–5 м. В чистую культуру выделены изоляты P. infestans из образцов, собранных в Ингушетии, Северной Осетии (только с сорта Горский), и в Ставропольском крае. Для сравнительного изучения использовали по одной полевой популяции из каждого региона. Для изучения структуры популяций использовались такие маркерные признаки, как тип спаривания, гены вирулентности, устойчивость к фунгициду «металаксил», спектр изоферментов пептидазы и гаплотипы митохондриальной ДНК. Количества собранных образцов и протестированных изолятов приведены в табл 1.

Тип спаривания определялся методом сращивания с тестерными штаммами с известными типами спаривания. Если исследуемый изолят образовывал ооспоры с тестером, имеющим тип спаривания А1, то его относили к типу спаривания А2, в противоположном случае – к А1. Если он образовывал ооспоры в монокультуре, то его считали самофертильным (СФ).

Определение генов вирулентности к картофелю проводилось на сортах дифференциаторах, полученных из международного картофельного центра (Лима, Перу) (Elansky et al., 2001). Сегменты листьев сортов-дифференциаторов (R1 – R11, за исключением R9) инокулировали суспензией конидий исследуемого изолята (5 конидий/поле зрения светового микроскопа при увеличении 80 раз). Пораженные сегменты листьев помещали во влажные камеры нижней стороной вверх и инкубировали при температуре 19^оС. Через двое суток инокуляционные капельки удаляли фильтровальной бумагой. Учет проводили на пятые сутки. Спороношение в месте инокуляции свидетельствовало о наличии гена вирулентности, соответствующего сорту–дифференциатору. Отсутствие спороношения было показателем отсутствия гена вирулентности.

Определение «томатных рас» проводили посредством заражений двух томатных сортов-дифференциаторов Талалихин 186 и Оттава 30. Если изолят не поражал их, то его считали авирулентным, если поражал только Талалихин, то его относили к расе Т0, и если заражал оба сорта, то его относили к расе Т1.

Определение устойчивости к металаксилу проводилина овсяной агаризованной среде с добавлением фунгицида. Чувствительность изолятов к фунгицидам оценивалась по скорости радиального роста колонии на среде с фунгицидом и без него (Shattock, 1988). Изолят считался чувствительным (S), если относительная скорость роста его колонии на среде с фунгицидом (при концентрации действующего вещества 10 мкг/мл) в сравнении со средой без фунгицида была менее 0.1; слабоустойчивым (SR) – при относительной скорости роста от 0.1 до 0.4; и устойчивым – более 0.4. Тест проводился в 3 повторностях для каждого изолята.

Определение спектров изоферментов локуса 1 глюкозо-6-фосфат изомеразы (Gpi–1) и двух локусов пептидазы (Pep-1 и Pep-2) проводили на целлюлозо-ацетатных гелях как описано в рекомендациях производителя для Gpi–1 (Hebert, Beaton, 1993), и с некоторыми модификациями для Pep–1 и Pep–2 (Elansky, Smirnov, 2003).

Определение митохондриальной ДНК проводили по методике, описанной в работе Griffith, Shaw, 1998. ДНК выделяли стандартным методом из растертого в жидком азоте мицелия (Elansky et al., 2001). Участок мтДНК амплифицировался с использованием праймеров F2–R2 и F4–F4 с последующей рестрикцией рестриктазами MspI (для участка, фланкированного праймерами F2–R2) и EcoRI (для участка F4–R4).

Определение встречаемости ооспор. Пораженные листья кипятили в 96% спирте 2-3 мин. до отхождения хлорофилла, обесцвечивали в 10% хлор-содержащем средстве «Белизна», и микроскопировали, проверяя 50 полей зрения (каждое 1мм²). Если ооспор встречалось менее 51, от 51 до 250, и более 250, то их встречаемость оценивали как редкую, умеренную или частую соответственно.

Результаты и обсуждение

В популяциях P. infestans встречались оба типа спаривания в сравнимом соотношении (табл. 2). Самофертильные изоляты были идентифицированы в СК и в РИ.

В исследованных популяцияхпреобладали сложные картофельные расы с числом генов вирулентности, близким к максимальному. Средняя вирулентность была высокой. Во всех исследованных популяциях преобладали гены вирулентности 1-4, 7, 10, 11. Значительно реже встречались гены 5 и 6 (табл. 3). Частота встречаемости гена R9 составила 5 и 27 % в популяциях РСО и СК соответственно.

Распределение томатных рас сильно варьировало. Все исследованные штаммы в СК имели томатную расу Т0, в РСО она также преобладала, хотя штаммы расы Т1 составляли значительную часть популяции. В РИ штаммы с расами Т0 и Т1 встречались в сравнимом соотношении (табл. 3).

В популяциях P. infestans зарегистрирован очень низкий уровень устойчивости к металаксилу (табл. 4). Только в популяциях в Кисловодске и Ингушетии мы обнаружили небольшой процент устойчивых изолятов. В остальных исследованных популяциях преобладали чувствительные штаммы.

Спектры изоферментов пептидазы и глюкозо-6-фосфат изомеразы Pep–1, Pep–2 и Gpi–1 в исследованных популяциях были сходными. Отмечен мономорфизм (100/100) локуса Gpi–1 во всех исследованных популяциях. По локусу Pep–1 преобладал генотип 100/100, также отмечена небольшая (4–14%) доля гетерозигот 92/100. По локусу Pep–2 также преобладал генотип 100/100, но было отмечено значительное число гетерозигот 100/112. Гомозигота 112/112 была выявлена в популяциях РСО и РИ (табл. 5).

В исследованных популяциях P. infestans встречались два гаплотипа митохондриальной ДНК – Ia и IIa при небольшом преобладании IIa (табл. 6).

Ооспоры в полевых популяциях встречались довольно редко (табл. 7). Их почти не было обнаружено в образцах из РКБ, РИ и РСО. Несколько чаще они встречались в образцах из СК.

В результате проделанной работы были получены первые результаты популяционных исследований P. infestans для Северного Кавказа, которые можно сравнивать с аналогичными данными для других регионов России. В исследуемых популяциях встречались оба типа спаривания и были зарегистрированы ооспоры. Хотя их находили довольно редко, можно полагать, что они вносят существенный вклад в генетическое разнообразие популяций. О последнем можно судить по результатам тестирования изоферментных локусов. В частности, по локусу Pep–2 обнаружены все три возможных аллельных состояния (две гомозиготы и гетерозигота). Соотношение их частот удовлетворяет уравнению Харди–Вайнберга для 95%–го уровня значимости (табл. 8). Конечно, небольшое число исследованных штаммов (от 12 до 27 в разных сборах) вносит высокую вероятность погрешности в вычислениях (Кайданов, 1996), поэтому утверждение о панмиксной структуре северокавказских популяций P. infestans, исходя из полученных данных неправомочно, однако некоторый вклад в соотношение частот генотипов аутбридинг вносит. Об этом свидетельствует и высокий процент расы Т1 у изолятов, выделенных из картофеля (особенно в Ингушетии). В Средней России такой высокий процент расы Т1 в «картофельных» изолятах наблюдается очень редко. По-видимому, определенный вклад в популяции, паразитирующие на картофеле, вносит инфекция, сформированная на томатах, в семенах и растительных остатках которых могут сохраняться ооспоры (Rubinetal., 2001).

Скорее всего, высокое генетическое разнообразие обусловлено распределением семенного картофельного материала. Лишь несколько сортов по первичной селекции связаны с местными регионами и, в основном, там районированы. Остальные сорта (их подавляющее большинство) поступают в хозяйства из других регионов – Краснодарского и Ставропольского краев, а также из Курской области. Нередок обмен готовой продукцией и семенным материалом между конкретными хозяйствами. В целом, генетическое разнообразие на Северном Кавказе превосходит таковое для большинства других исследованных регионов Российской Федерации (Дальний Восток, Сибирь, Центральные и Северные районы). Оно сравнимо лишь с данными по Московской области, где генетическое разнообразие очень велико (Еланский и др., 1999a, Elansky et al, 2001, Elansky, Smirnov, 2003).

Анализ изоферментов и гаплотипов митохондриальной ДНК показал, что сегодняшние популяции P. infestans соответствуют популяциям нового типа. Гаплотип Ib и аллель 86 Gpi–1, соответствующие широко распространенному в прошлом клону US–1, обнаружены не были. Отметим, что новый для популяционных исследований маркер – локус пептидазы Pep–2 (Elansky, Smirnov, 2003) – выявил высокий полиморфизм в северокавказских популяциях.

На территории Северного Кавказа проводят довольно много обработок фунгицидами. Однако в течение последних лет фениламидные препараты стали постепенно исключать из схем обработок. Их заменили такими более новыми препаратами, как ордан, акробат MЦ, абигопик, купросат и полихом. Этим можно объяснить отсутствие устойчивых к металаксилу штаммов или их низкую встречаемость в исследованных регионах Северного Кавказа. Сходная тенденция наблюдается и в большинстве других регионов Российской Федерации (Еланский и др., 1999b; Elansky et al., 2001).

По вирулентности к картофелю северокавказские популяции были сходными с популяциями из других регионов России. В них преобладали комплексные расы с большим количеством известных генов вирулентности. Значения средней вирулентности были высокими. Наиболее редкими, как и в большинстве популяций РФ (Elansky et al., 2001), были гены R5 и R6. Таким образом, на территории Северного Кавказа, как и везде, реализуется тенденция увеличения патогенности штаммов P. infestans. Расчеты индекса разнообразия Шеннона (Мэгарран, 1992) показали, что наиболее разнообразна по расовому составу популяция из РИ (индекс разнообразия равен 2.56). Для нее характерны, во-первых, общее высокое разнообразие рас, во-вторых, наибольший процент редких генов вирулентности (R5, R6, R8, табл. 4) и, в третьих, наибольший процент расы Т1. Разнообразие рас в коллекциях из РСО и СК было несколько ниже (индексы Шеннона 1.88 и 1.77 соответственно) и достоверно не различалось (табл. 9), в то время как между популяциями из РСО и РИ, а также РИ и СК наблюдались достоверные различия. Исследования Политыко (1994) также показали присутствие в Северной Осетии многих рас с различными наборами генов вирулентности. Они включали в себя гены 1–3, 5–11, а также х, у и z. Встречаемость гена 4 варьировала в полевых популяциях. Возможно, преобладание комплексных рас с большим числом генов вирулентности связано с большим разнообразием выращиваемых в северокавказском регионе сортов картофеля. Сходная ситуация наблюдается в большинстве стран мира.

Популяции P. infestans на Северном Кавказе имели ограниченное сходство с высокогорной мексиканской популяцией гриба в долине Толука. Так, в обеих популяциях стабильно встречались оба типа спаривания в сравнимом соотношении. Однако в Кавказских популяциях мы не наблюдали регулярного и массового образования ооспор (табл. 8), а генетическое разнообразие по изоферментным локусам Pep–1 и Gpi–1 было довольно ограниченным. В этих аспектах северокавказские популяции ближе к равнинным популяциям из других регионов Российской Федерации. Видимо, это связано с их экологическими особенностями (климатическими, разнообразием растений-хозяев). В то же время популяции Северного Кавказа могут служить одним из источников увеличения генетического разнообразия в других регионах России из-за активного обмена с ними как готовой продукцией, так и семенным материалом. Так, семеноводческое хозяйство в районе Кисловодска, с полей которого была выделена кисловодская коллекция штаммов, продает элитный семенной картофель для многих районов юга России и Поволжья.

В условиях Северного Кавказа фитофтороз до сих пор остается серьезной и нерешенной проблемой. Ее практическое решение связывали с усилением применения химического метода защиты картофеля. Однако обратная связь защиты с данными по популяционной структурой возбудителя была недостаточной, а в ряде регионов отсутствовала. Мы полагаем, что наше исследование – один из первых шагов в устранении этих пробелов.

Авторы благодарят В.П. Апрышко и А.С. Кравцова за помощь в работе. Работа выполнена при поддержке Российского фонда фундаментальных исследований (грант № 02–04–81031).

Список литературы

Багирова С. Ф., Ань Цзянь Ли, Дьяков Ю. Т. Роль ооспор в перезимовке гриба Phytophthora infestans (Mont.) de Bary // С.-х. биология 1996. №3. С.69–71.

Бессмельцев В.И. Итоги и задачи в изучении грибных болезней пшеницы и картофеля// Матер. юбилейного заседания ученого совета СКНИИФ, посвященного 30-летию создания института. Проблемы защиты растений для Северного Кавказа. Краснодар, 1991. – С. 69-70.

Бордукова М.В. Зимовка Phytophthora infestans в условиях Московской области // Вест. с.-х. наук. 1940. Вып. 3 . С. 20–26.

Букасов С.М. , Камераз А.Я. Селекция и семеноводство картофеля. Л.: Колос, 1972. С. 358.

Виноградова Н.В., Катаева О.Е. Картофель в Северной Осетии. Дзауджикау: 1953. С. 65.

Воробьева Ю.В., Кваснюк Н.Я., Гриднев В.В. и др. Защита картофеля от фитофтороза в система семеноводства // Защита растений. 1991. №5. С. 17–20.

Дорожкин Н.А., Бельская С.И. Перезимовка, источники инфекции и цикл развития Phytophthora infestans (Mont) de Bary // Микология и фитопотология. 1975. Т. 9, в.5. С. 405–408.

Eланский С.Н., Смирнов А. Н., Долгова А.В., Дьяков Ю.Т. Популяции Phytophthora infestans в Московской области. I. Системы размножения// Микология и фитопатология. 1999а. Т.33, в.5. С. 343–352.

Eланский С.Н., Смирнов А. Н., Багирова С.Ф., Дьяков Ю.Т. Популяции Phytophthora infestans в Московской области. II. Сравнительная структура популяций, паразитирующих на картофеле и томатах // Микология и фитопатология. 1999б. Т.33, в.5. С. 353–359.

Кайданов Л.З. Генетика популяций. М.: Высш. Школа, 1996.

Мэгарран Э. Экологическое разнообразие и его измерение. М.: Мир, 1992.

Новотельнова Н.С. Фитофторовые грибы // Л.: Наука,1974.

Политыко В. А. Биологические основы развития возбудителя фитофтороза картофеля Phytophthora infestans (Mont.) de Bary в Северной Осетии и обоснование мер борьбы: Автореф. канд. дис. М., 1994.

Elansky S. N., Smirnov A. N. Second locus of Peptidase as a marker for genetic investigations of Phytophthora infestans // Botanica Lithuanica. 2003. Vol. 9(3). In press.

Elansky S., Smirnov A., Dyakov Y., Dolgova A., Filippov A., Kozlovsky B., Kozlovskaya I., Russo P., Smart C., Fry W. Genotypic analysis of Russian Phytophthora infestans isolates from the Moscow region, Siberia and Far East.// J. Phytopathol. 2001. Vol. 149. P. 605–611.

Griffith G.W., Shaw D.S. Polymorphism in Phytophthora infestans: four mitochondrial haplotypes are detected after PCR amplification of DNA from pure culture or from host lesion // Applied and Env. Microbiol. 1998. Vol.64 (10). P.4007–4014.

Hebert P. D. N., Beaton M. J. Methodologies for allozyme analysis using cellulose acetate electrophoresis. A practical handbook// Guelph, Ontario, An educational service of Helena laboratories. 1993.

Rubin E., Baider A., Cohen Y. Phytophthora infestans produces oospores in fruits and seeds of tomato // Phytopathology. 2001. Vol. 91. P. 1074–1080.

Shattock R. C. Studies on the inheritance of resistance to metalaxyl in Phytophthora infestans//Plant Pathol. 1988. Vol. 37. P. 4–11.