Публикации и СМИ

Инновационная технология диагностики вирусов картофеля методом иммунохроматографии на тест-полосках

Д.В. Кравченко, A.И. Усков, Ю.А. Варицев, п. Красково Московской области

Массовый мониторинг зараженности посадочного материала картофеля вирусами возможен при использова­нии простых, надежных и высокочувствительных лабораторных методов для широкого круга вирусов растений. В настоящее время в России лабораторная диагностика вирусных инфекций картофеля осуществляется в основном с по­мощью методов твердофазного иммуноферментного анализа (ИФА). Эти методы позволяют количественно определять вирусы растений в экстрактах листового материала до концентрации 1 нг/мл. В последнее время большое внимание уделя­ется разработке новых простых лабораторных экспресс-методов, позволяющих проводить анализы в полевых условиях без оборудования и специальных навыков (Блинцов и др., 2008).

В настоящей работе представлена высокочувствительная и простая технология визуальной диагностики вирусных ин­фекций картофеля на поликомпозитных мембранных тест-полосках, разработанных учеными биологического факультета МГУ им М.В. Ломоносова совместно с НИИ ФХБ им. А.Н. Белозерского, ЗАО «НВО Иммунотех» и ВНИИКХ им. А.Г. Лорха.

В задачи лабораторных испытаний иммунохроматографических тест-полосок для диагностики ХВК, МВК и УВК, про­веденных в отделе биотехнологии ВНИИКХ, входило:

Выявить время анализа в неосветленных экстрактах листьев картофеля.

Определить порог детекции и рабочий диапазон вирусов картофеля в неосветленных экстрактах листьев здорового растения картофеля.

Оценить пригодность тест-системы для выявления вируса картофеля в неосветленных экстрактах листьев различных сортов картофеля. Оценить соответствие результатов выявления вируса картофеля в листьях зараженных и здоровых растений картофе­ля с помощью иммуноферментной и иммунохроматографической тест-систем.

Оборудование, материалы, реагенты для проведения исследований:

• тест-системы, подлежащие испытанию;
• очищенный препарат вируса картофеля с известной концентрацией (определенной спектрофотометрически согласно коэффициенту экстинкции Е (260 нм, 1 см 1 мг/мл);
• экстрагирующий буфер: 0,01 М калий-фосфатный буфер, рН 7,2-7,5, содержащий 0,1 М NaCI, 0,1% Тритон Х-100;
• листья здоровых растений картофеля;
• листья растений картофеля, зараженных вирусами согласно результатам проверки методом иммуноферментного
  анализа (ИФА) с помощью иммуноферментных наборов производства ВНИИКХ;
• пробирки пластиковые для образцов емкостью 1,5-2 мл;
• пластиковые или стеклянные лабораторные стаканы емкостью 20-50 мл;
• фарфоровые ступки.

Методика исследований

Перед началом работы тест-системы и образцы листьев растений картофеля выдерживали при комнатной температуре (+18-25°С) в течение 10-15 мин. В комплектацию иммунохроматографической тест-системы для выявления вирусов картофеля должны входить:

• десять тест-полосок, упакованных в индивидуальную упаковку, содержащую пакетик с осушителем (силикагель);
• один флакон, содержащий 50,0 мл экстрагирующего буфера.

Приготовление неосветленного экстракта листьев картофеля (1:10, вес/объем). Готовили навеску листьев массой 200±20 мг и помещали в 2,0 мл экстрагирующего буфера. Растирали в фарфоровой ступке в течение 3—5 мин. Полученный экс­тракт переносили в пробирку емкостью 3 мл. Препараты соответствующих вирусов картофеля разводили до нужной кон­центрации экстрагирующим буфером или неосветленным экстрактом листьев здорового растения картофеля. Тест-полоски извлекали из упаковки и помещали в исследуемые образцы. Отмечали появление меток в аналитической зоне иммунохро­матографической мембраны.

Результаты исследований

1. При исследовании тест-систем на ХВК, МВК, УВК при добавлении данных вирусов в концентрации 50 нг/мл как в буфер, так и в сок здоровых растений картофеля время анализа установлено как 10 минут нахождения тест-полоски в образце. При этом отмечено появление второй отчетливой полосы, сигнализирующей о наличии вируса X, в системе PVY полоса была менее отчетливой, в системе PVM наблюдали фон в контроле (без вируса), одновременно в системе PVX и PVY в контроле констатировали отсутствие второй полосы.
2. При определении порога детекции и рабочего диапазона тест-системы на PVX установлено, что через 10 мин. анализа вторая полоса проявляется в диапазоне концентраций от 1000 до 8 нг/мл (исследовался диапазон 1000-2 нг/мл). Через 20 мин. чувствительность была 2 нг/мл. В системе PVY через 10 минут выявлялись концентрации 1000-32нг/мл, через 20 мин. до 8 нг/мл. В системе PVM через 10 минут -1000 -16 нг/мл, через 20 минут - до 8 нг/мл.
3. При определении пригодности тест-системы для выявления вируса картофеля в неосветленных экстрактах листьев различных сортов картофеля вероятность выявления PVX в концентрации 10 нг/мл составила 100%, PVM -100%, PVY-60%.
4. При изучении соответствия результатов выявления вируса в картофеле в зараженных и здоровых листьях растений картофеля с помощью иммуноферментной и иммунохроматографической тест-систем вероятность выявления PVX со­ ставила 100% для препаратов, содержащих этот вирус по данным ИФА, и 0% - для препаратов, не содержащих вирус. Вероятность выявления PVY составила 89,1% для препаратов, содержащих этот вирус по данным ИФА и 0% - для препаратов, не содержащих вирус по данным ИФА. Тест-система на PVM не смогла быть оценена из-за фоновой реакции. Иммунохроматографические тест-полоски были способны выявлять вирусы картофеля как в соке зеленых листьев карто­феля, так и в соке ростков картофеля. Полевые испытания разработанной иммунохроматографической тест-системы были проведены в 2008 году при отборе базовых здоровых клонов из БЗСК в Архангельской области (таблица 1).

Как видно из данных, представленных в таблице, иммунохроматографические тест-полоски пригодны для практическо­го применения в полевых условиях. Всего было продиагностировано 28 сортов картофеля. По каждому сорту оценено по 10 клонов, по сорту Жуковский ранний - 60 клонов, по сорту Удача - 70 клонов. Полностью здоровыми по данным имму-нохроматографии оказались клоны сортов Каратоп, Наяда, Малиновка, Ред Скарлетт, Любава, Кураж, Чародей, Ильинский, Белллароза, Солист. Высокий выход здоровых клонов (70-90%) наблюдали у сортов Брянский надежный, Лорх, Ладожский, Никулинский, Роко, Голубизна, Жуковский ранний, Удача, Ресурс, Крепыш, Розара, Импала, Латона, Рябинушка, Накра. Наибольшим процентом выбраковки больных клонов характеризовались сорта Раменский, Невский, Холмогорский.

Таблица 1

Отбор базовых клонов по результатам иммунохроматографического анализа

При помощи иммунохроматографических тест-полосок среди всех сортов были выявлены: PVX - в 23 клонах, PVY - в 15 клонах, PVM - в 21 клоне. Это подтверждает эффективность применения данной диагностической системы для выявления наиболее распространенных и опасных вирусов картофеля в полевых условиях. Отобранные клоны, здоровые по данным иммунохроматографии, в настоящее время дополнительно анализируются глазковым тестом с использованием ИФА.

В настоящее время во ВНИИКХ проводятся исследования по совершенствованию и существенному упрощению процесса приготовления диагностируемых образцов из растительного материала в полевых условиях без применения специальных приборов и инструментов.

Таким образом, технология экспресс-диагностики вирусов картофеля на иммунохроматографических тест-полосках представляет собой доступный инструмент для получения здорового семенного материала картофеля. Ее основные до­стоинства по сравнению с методом ИФА - быстрота проведения анализа (10-15 мин. вместо 2-х дней), независимость места проведения анализа от наличия помещения и оборудования. Вместе с тем недостатком данной технологии является ее вы­сокая трудоемкость при проведении массовых анализов. Данная технология может найти широкое применение как среди крупных производителей семенного картофеля, лабораторий по производству оригинального исходного материала, так и среди картофелеводов-любителей, владельцев личных подсобных хозяйств и дачных участков.

Во ВНИИКХ осваивается производство коммерческих диагностических наборов для лабораторной идентификации виру­сов картофеля на основе иммунохроматографических тест-полосок.